ОПИСАНИЕ ПРОЦЕССА ИССЛЕДОВАНИЯ

Из пуповинной крови новорожденного, собранной при рождении, выделяется ДНК и подготавливается к прочтению (секвенированию). Секвенирование ДНК проводится на платформе NovaSeq 6000 (WES, whole exome sequencing, секвенирование полного экзома). Полноэкзомное секвенирование представляет собой прочтение всех кодирующих последовательностей экзонов генов и прилегающих интронных областей. Для обогащения целевыми фрагментами используется набор для обогащения xGen Exome Hyb Panel v2.

Обработка данных секвенирования проводится с использованием алгоритма, включающего выравнивание прочтений на референсную последовательность генома hg38, коллинг и фильтрацию вариантов по качеству. Для всех вариантов, прошедших фильтрацию по качеству, проводится аннотация с использованием Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) и применением ряда алгоритмов предсказания значимости вариантов (SIFT, PolyPhen-2, SpliceAI).

Для оценки популяционных частот выявленных вариантов используется база данных Genome Aggregation Database (gnomAD). Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов применяются базы данных ОМIМ, ClinVar, HGMD и другие базы данных по конкретным генам (при их наличии).

Оценка клинической значимости (патогенности) выявленных вариантов проводится на основе рекомендаций ACMG и российских рекомендаций по интерпретации данных, полученных методами высокопроизводительного секвенирования [Richards et al., 2015; Nykamp et al., 2017; Рыжкова и др., 2019].

В заключение включаются патогенные и вероятно патогенные варианты без конфликта интерпретации, которые приводят к развитию моногенных заболеваний, манифестирующих в детском возрасте. При наличии информированного согласия представителя новорожденного на проведение расширенного исследования (см. https://exome.ncagp.ru/documents.php) в заключение также включаются варианты, ассоциированные с моногенными заболеваниями, манифестирующими во взрослом возрасте, а также проявляющиеся с неполной пенетрантностью, в том числе случайные находки, согласно списку генов для сообщения вторичных находок ACMG, за исключением не описанных ранее у пациентов вариантов в гене TTN, приводящих к потере функции белка, что связано с противоречивыми данными о патогенности такого типа вариантов [Miller et al., 2021; McGurk et al., 2022]. Выявление и анализ вариантов для здоровых новорожденных проводится полуавтоматическим методом, разработанным в ходе НИОКТР 121092400060-5 https://www.rosrid.ru «Разработка технологии и методологии формирования генетического паспорта (карты генетического здоровья) новорожденных и их применение для оценки частот встречаемости генетических нарушений с низкой/средней пенетрантностью в российской популяции и выявления генетических факторов, обуславливающих тяжелые моногенные заболевания». Суть метода заключается в использовании информации из баз данных, касающейся типов наследования, патогенности конкретных вариантов в гене, а также наличия гомо/гемизиготных и потенциально компаунд-гетерозиготных вариантов, ассоциированных с рецессивными заболеваниями, и редких гетерозиготных вариантов в генах, для которых описаны доминантные формы заболеваний. Следует отметить, что для некоторых ассоциированных с сообщаемыми вариантами заболеваний на сегодняшний день может не существовать лечения/профилактики. Важно отметить, что метод не является исключающим: невыявление вариантов не исключает наличия моногенного заболевания, манифестирующего в детском возрасте (см. ниже ограничения методики). Значимость обнаруженных вариантов может меняться с течением времени при накоплении научных и клинических данных.

Методика имеет ряд ограничений, связанных с техническими особенностями полноэкзомного секвенирования: метод не позволяет выявлять инсерции и делеции длиной более 10 пар нуклеотидов, варианты в интронных областях (за исключением канонических сайтов сплайсинга), вариации длины повторов (в том числе экспансии триплетов). Метод не предназначен для определения цис- или транс-положения пар гетерозиготных вариантов, а также для оценки уровня метилирования, выявления хромосомных перестроек, полиплоидии, выявления вариантов в состоянии мозаицизма; затруднено выявление вариантов в генах при наличии псевдогена (или другой высокогомологичной последовательности). В ходе данного исследования анализируются варианты нуклеотидной последовательности из ограниченного списка генов, ассоциированных с развитием известных моногенных заболеваний, манифестирующих в детском возрасте, с которым можно ознакомиться ниже.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ И БАЗ ДАННЫХ

• https://omim.org/
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
• https://gnomad.broadinstitute.org/
• Richards et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015 May;17(5):405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30
• Рыжкова О.П. и соавт. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. doi:10.25557/2073-7998.2019.02.3-23
• Nykamp K et al. Sherloc: a comprehensive refinement of the ACMG-AMP variant classification criteria. Genet Med. 2017 Oct;19(10):1105-1117. doi: 10.1038/gim.2017.37
• Miller et al. Recommendations for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing, 2021 update: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2021 Aug;23(8):1391-1398. doi: 10.1038/s41436-021-01171-4
• McGurk et al. Correspondence on "ACMG SF v3.0 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)" by Miller et al. Genet Med. 2022 Mar;24(3):744-746. doi: 10.1016/j.gim.2021.10.020

Ниже предлагаем вам ознакомиться с таблицей генов, варианты в которых ассоциированы с наследственными заболеваниями. Обращаем ваше внимание на то, что обладать патогенностью может не сам ген, а вариант в гене. Поэтому один и тот же ген может подвергаться анализу и в базовом, и в расширенном исследовании.